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本试剂盒适用于酵母RNA的提取，酵母细胞经lyticase Enzyme处理去除细胞壁后，独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 低温(4℃/-20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃～25℃)进行。
  
• Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，-20℃保存。蜗牛酶是从蜗牛的嗉囊和消化道中制备的混合莓，它含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 需要自备乙醇，β-巯基乙醇，水浴锅。
  
• 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!
  
• 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL RLT中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。
  
• 吸取使用量的缓冲液SE加入0.1%β-巯基乙醇备用。

• 小量酵母培养细胞
  
  • 收集1mL （约10⁷细胞）处于对数生长期酵母培养物到1.5mL离心管，12000rpm离心30秒，尽可能吸弃上清。
    
  • 加入100μL缓冲液SE中（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.1%），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入约50U lyticase，充分颠倒混匀，37℃温育15～30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
    
    • 如果破壁效果不好导致RNA产量低，可以加大lyicase用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合Lyticase消化的酵母可选用Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。
  • 加入350μL裂解液RLT（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%），吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
    
    • 一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13000rpm离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
  • 加入250μL 96-100％乙醇，立即吹打混匀，不要离心。
    
  • 接操作步骤项下3。
• 中量酵母培养细胞
  
  • 收集2～3mL（约3×10⁷细胞）处于对数生长期酵母培养物到1.5mL离心管（超过1.5mL可分两次在同一个离心管内进行收集细胞），12，000rpm离心30秒，尽可能吸弃上清。
    
  • 加入600μL缓冲液SE中（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.1%），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入约100～150U lyticase，充分颠倒混匀，37℃温育15～30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
    
    • 如果破壁效果不好导致RNA产量低，可以加大lyicase用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合Lyticase消化的酵母可选用Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。
  • 13000rpm离心1分钟，尽可能吸弃上清。
    
  • 加入350μL裂解液RLT（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%），吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
    
    • 一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13000rpm离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
  • 加入等体积70％乙醇（DEPC水配制，约350μL）立即吹打混匀，不要离心。
    
  • 接操作步骤项下3。
• 将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心30～60秒，弃掉废液。
  
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
  • 如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
• 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase free water（事先在70～80℃水浴中加热），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
• 如果预期RNA产量>30μg，加30～50μL RNase free water重复步骤7，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

• 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
  
• 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
  
• 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。
  
• 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。

• 完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
  
• 纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mMTris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
  
• 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
  
  终浓度(ng/μL)= (OD260)×(稀释倍数n)×40